冻存管怎么灭菌【全面】无菌检验、微生物限度检验用菌种的保藏与管理

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1.菌种保藏步骤

1.1挑选特征典型的纯菌菌落。其方法是用接种环挑取少许菌苔，接种至2ml营养肉汤或0.9%氯化钠溶液中制成菌液，再取一环菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后可见单个菌落生长。

1.2凡能产生孢子或芽胞的微生物都用孢子和芽孢进行保种。孢子和芽胞的代谢作用较弱，但对恶劣环境有很强的抵抗。在传代前，将菌液管放入80℃水浴中作用30分钟，杀死杂菌繁殖体后用芽孢传代。 

1.3定期对保藏菌种进行检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退，检查项目包括菌落形态、染色、镜检、生化特性及血清学检查。

1.4选择适宜的培养基及保藏方法。

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2.常用菌种的保藏方法

2.1普通琼脂斜面  用于常用菌株的传代。在营养琼脂培养基内按0.5%加入琼脂粉配制而成。接种培养后，将菌种管用硅胶塞塞紧，置4℃冰箱保存，每隔2～3个月传种1次。铜绿假单孢菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，其菌种须放25℃培养箱内保存。

2.2半固体琼脂  用于常用菌株的传代。在营养肉汤培养基内按0.5%加入琼脂粉配制而成。穿刺接种培养后，置4℃冰箱保存，6个月传种1次。如在培养管内加少量无菌液体石蜡隔绝空气，减少水分蒸发，可延长菌种的保藏期。

2.3真菌琼脂斜面  用于真菌的传代。在真菌培养基内按1.3%加入琼脂粉配制而成。划线接种后，20～25℃培养24小时，置4℃冰箱保存，3～6个月传种1次。

2.4沙氏琼脂斜面  用于真菌的传代。配方：蛋白胨10g ，葡萄糖10g，琼脂粉13g，加蒸馏水1000mL，待上述成分溶化后，摇匀分装，115℃灭菌20分钟，趁热摆成斜面。划线接种后，20～25℃培养24小时，置4℃冰箱保存，3～6个月传种1次。 

2.5 40％甘油水  用于细菌的传代。配制方法：甘油40mL加水至100mL即成。分装至试管内，每支2mL左右，121℃灭菌20分钟备用。接种细菌后直接放4℃冰箱保存，6～12个月传代1次。 

2.6需气菌、厌气菌培养基  用于生孢梭菌的传代。取生孢梭菌CMCCB64941菌液1mL至需气菌、厌气菌培养基15mL内，30～35℃培养18～24h，置4℃冰箱内保存3～6个月传种1次。 

2.7 疱肉培养基  用于破伤风梭菌的传代。取破伤风梭菌CMCCB64067菌液0.1mL接种于疱肉培养基内，36℃±1℃厌氧培养3～4天，置4℃冰箱保存，6～12个月传代1次。 

2.8 液氮超低温保藏法  适用于各类微生物的保藏。液氮温度可达-196℃，此时菌种的新陈代谢活动已停止，但不会死亡。在配制好的菌液内加10％甘油作为保护剂，分装于安瓿中，置液氮罐内可保存10年之久。

2.9冷冻真空干燥保藏法  本法广泛适用于各类微生物的保藏，包括病毒和噬菌体。将菌液混于有保护作用的介质内，分装于灭菌菌种管内，速冻后抽真空，使菌液很快变为疏松的干燥菌粉，最后在真空状态下密封管口，菌种保存期最长可达20年以上。

2.10常用菌种的保藏条件及传种时间，见表1。

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3．菌种检查与复壮

菌种在传代保藏过程中，易发生衰退、变异、污染和死亡，因此必须定期检查。将菌种接种至液体培养基内使之复活，重新分离，纯化形成单个菌落，再作菌种鉴定，包括菌落形态、颜色，染色性、镜下观察菌体形态等，必要时可做生化试验及血清学反应。

菌种经人工传代保藏过程中，由于自发突变而引起特性变弱或消失往往为菌种衰退。使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性，称为菌种复壮。常用方法有：

①分离纯化：将菌种接种至营养肉汤培养基培养24小时，取菌液在营养琼脂平板上分区划线，培养后挑取典型单个菌落。 

②宿主复壮：将退化菌种接种到相应昆虫或动植物宿主体内，传种数代可恢复其原有的特性与毒力。

③抗逆复壮：通过极端的逆境处理使那些退化的细菌死亡，选育健壮的传代保种。

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4．实验菌种的管理

菌种应放入专用冰箱，实行双人、双锁保管。菌种应有购入记录，传代记录，领用记录和销毁记录。菌种应定期检查、分离、纯化，以防菌种变异及衰退。菌种传代应不超过五代。 

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一、为避免污染造成的损失，在冻存细胞前，应该检查细胞是否污染以及细胞的密度和细胞的活力。

二、细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，经实验证明这样可以最大限度的保存细胞的活力。缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶的形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

三、操作步骤

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(一)细胞冻存

1.配制含10%DMSO、10-20%小牛血清的冻存细胞培养液；

2.用胰蛋白酶将选好的细胞消化下来，消化时一定要掌握好消化的时间，如果时间处理不当，就会导致细胞的死亡，且细胞瓶中的胰酶残留尽量倒干净；

3.将消化好的细胞加入适量配制好的冻存培养液，用注射器或吸管轻轻吹打使细胞均匀；

4.将细胞悬液分装入冻存管中，每管1~1.5mL；

5.在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

6.冻存的过程：将冻存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱过夜，取出冻存管移入液氮容器内。

（二）细胞复苏

1.佩戴厚点的手套，从液氮罐中取出冻存管快速直接放入37℃温水中，并不时摇动使其在1分钟内快速融解；

2.在无菌下从水浴中取出冻存管，冻存管用75%酒精擦拭消毒后，打开盖子，用吸管或注射器吸出细胞悬液注入离心管中，由于离心管中细胞悬液较少所以再加入适量的培养液混匀；

3.离心，在1000rpm离心5min；

4.将离心管取出，弃去上清液，向离心管中加入含10%小牛血清细胞培养液用吸管或注射器吹打后接种于培养瓶，37℃培养箱静止置培养；

5.7~8小时后换液继续培养。

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四、注意事项

1.由于冻存的细胞还受其他因素影响，因此可能有部分死亡细胞，此时在换液时可将不贴壁和漂浮在培养液上已死亡的细胞轻轻倒掉，再补充新的培养液；

2.冻存和复苏细胞时最好用新配制的培养液；

3.冻存管存取时一定要做好防护工作，以免冻伤。